Nato a Cartagena intorno al 560 da famiglia nobile, Isidoro rimase orfano ancora bambino e fu allevato dal fratello maggiore Leandro.
L'inizio dei suoi studi non fu brillante ma, secondo una tradizione, fu il notare il solco scavato dalla corda nel bordo di pietra di un pozzo che lo tece riflettere sul potere della perseveranza: da allora si sarebbe dedicato ad apprendere tanto da essere annoverato fra i più sapienti del suo tempo.
Isidoro intraprese la carriera ecclesistica e divenne chierico a Siviglia, quando il fratello Leandro morì nel 600 gli succedette nella carica di vescovo della città. Si dedicò con passione agli oneri dell'episcopato e nel 633 presiedette il concilio di Toledo, ma profuse energia ed impegno anche nella composizione delle sue numerose opere di erudizione nelle quali trattava di tutte le discipline note ai suoi tempi.
Scrisse opere storiche, trattò di esegesi, grammatica, teologia e compose una grande opera enciclopedica in venti volumi intitolata Etymologiae.
Morì a Siviglia il 4 aprile 636.
Santo (festa il 4 aprile), Dottore della Chiesa, patrono di Siviglia, di Internet e dei programmatori.