Figlia di Leopoldo V d'Asburgo-Tirolo, fratello minore di Ferdinando II, e di Claudia de' Medici, nacque a Innsbruck il 6 aprile 1632.
Nel 1648 sposò l'imperatore Ferdinando III d'Asburgo vedovo della prima moglie Anna Maria di Spagna. Con il matrimonio Maria Lepoldina acquisì i titoli di imperatrice e di regina di Boemia e di Ungheria.
Morì di parto a Vienna il 7 agosto 1649 mettendo al mondo il suo unico figlio Carlo Giuseppe.
Ferdinando III si risposò due anni dopo con Eleonora Gonzaga-Nevers.