Figlio di Cosimo I de'Medici e di Eleonora di Toledo, nacque a Firenze nel luglio 1549, ebbe il nome da Ferdinando d'Asburgo suo padrino di battesimo e futuro imperatore.
Quando nel novembre 1562 le febbri malariche uccisero Giovanni e Garzia fratelli maggiori di Ferdinando, questi divenne il secondo erede al tron o ducale dopo il primogenito Francesco.
Nel 1563, non ancora quattordicenne, fu nominato cardinale in sostituzione del defunto fratello Giovanni da Pio IV, tuttavia non prese mai i voti. Nonostante gli ottimi precettori di cui disponeva si dimostrò sempre poco interessato allo studio e la sua scarsa conoscenza del latino gli procurò spesso i rimproveri del padre e lo scherno degli avversari.
Alla morte di Pio IV, nel 1565, Ferdinando si recò a Roma per partecipare al conclave, venne eletto Michele Ghislieri che prese il nome di Pio V, appartenente alla fazione contraria ai Medici che faceva capo a Alessandro Farnese, in considerazione di ciò Ferdinando fu trattenuto in Toscana fino al 1569 quando, migliorati i rapporti fra Pio V e Cosimo I, il giovane cardinale si stabilì a Roma.
Qui si dedicò soprattutto a tessere una fitta rete di relazioni, alleanze e clientele. Si attivò per il riconoscimento da parte dell'impero e della Spagna del titolo di granduca conferito dal papa a Cosimo I e in generale curò con attenzione i rapporti politici della sua famiglia con la Chiesa.
Pio V morì nel 1572 e il conclave elesse Gregorio XIII (Ugo Boncompagni), favorevole ai Medici con il quale, tuttavia, Ferdinando non ebbe sempre rapporti amichevoli.
Importanti per la sua successiva esperienza di granduca furono anche gli incarichi di amministrazione della città di Roma svolti per il papato. Nel 1576 acquistò la dimora romana che chiamò Villa Medici e iniziò le opere di restauro e ampliamento completate nel 1588.
Curò le trattative matrimoniali della nipote Eleonora, figlia del fratello Francesco, con Vincenzo Gonzaga e quelle della sua sorellastra Virginia con Cesare d'Este.
Con i suoi buoni uffici presso Gregorio XIII protesse il nipote Virginio Orsini in pericolo per torbide vicende familiari e il feudatario Alfonso Piccolomini che si era dato al banditismo con il segreto consenso di Francesco de'Medici.
I rapporti di Ferdinando con Francesco, al quale il padre aveva ceduto il potere nel 1564 furono sempre difficili. Ferdinando riteneva il fratello troppo rigido nella sue posizioni e in sostanza incapace di gestire una conveniente politica di relazioni con altri stati ad eccezione della Spagna, Francesco al contrario criticava la disponibilità di Ferdinando alla mediazione e al compromesso che riteneva eccessiva.
La duratura relazione di Francesco con Bianca Capello, inoltre, era malvista da Ferdinando e quando Francesco rimasto vedovo sposò Bianca il pericolo di eventuali ingerenze sulla successione rese i rapporti ancora più tesi.
Il 10 aprile 1585 morì Gregorio XIII e questa volta Ferdinando giocò un ruolo molto importante nel far confluire i voti del conclave verso Felice Peretti che prese il nome di Sisto V. Aveva in questo modo rinunciato a sostenere un candidato della fazione medicea ma aveva anche evitato la possibile elezione di Alessandro Farnese.
Il 19 ottobre 1587 Francesco morì a Poggio a Caiano, seguito il giorno successivo da Bianca Capello. Ferdinando ereditò il titolo di Granduca e gli immensi possedimenti del fratello. Per evitare sospetti di veneficio fece eseguire l'autopsia sui corpi di Francesco e Bianca, quindi fece seppellire la cognata in forma privata escludendola dalle esequie di Francesco.
Il 25 ottobre 1587 prese ufficialmente il potere con l'acclamazione degli organi istituzionali fiorentini.
Ferdinando non si dimostrò rigidamente legato alla Spagna di Filippo II come aveva fatto il fratello ma preferì aprire la politica del granducato a più ampie relazioni anche con Venezia, la Francia e gli Estensi.
Continuò a coltivare intensi rapporti con la curia romana facendo pesare la propria influenza anche sui conclavi successivi alla morte di Sisto V. Il 14 dicembre 1588 rinunciò alla carica di cardinale e nel 1589 sposò Cristina di Lorena, figlia del duca Carlo III di Lorena e di Claudia di Francia, dalla quale ebbe nove figli.
Appoggiò Enrico III di Valois e, dopo l'assassinio di questi, Enrico IV convincendo quest'ultimo a convertirsi al Cattolicesimo, conversione poi accettata da Clemente VIII. Condusse queste operazioni tramite accordi segreti e relazioni indirette, così come fece con Elisabetta I d'Inghilterra con vantaggio dei commerci toscani con gli Inglesi.
Intorno al 1590 Filippo II di Spagna, ormai in aperto contrasto con il Granduca, minacciò di destituirlo e aumentò i sui presidi militari ai confini toscani, inoltre sfruttò in azioni di brigantaggio ai danni del granducato il bandito Piccolomini (che finì impiccato nel 1593) e chiamò alla corte spagnola Don Pietro de' Medici, fratello minore e avversario di Ferdinando.
Negli anni 1594 e 1595 Ferdinando inviò contributi finanziari e contingenti militari da impegnare contro i Turchi all'imperatore Rodolfo II d'Asburgo e a Sigismondo Bathory principe di Transilvania.
Grandissime risorse furono investite per lo sviluppo del porto e della città di Livorno, si trattava di creare un nuovo canale comnmerciale per grandi quantitativi di grano provenienti da vari porti europei e rivenduti in concorrenza con il regno di Napoli. Seguendo una linea di condotta idealmente tracciata da Cosimo ma con maggiore ampiezza di vedute, Ferdinando dichiarò Livorno porto franco con grande impulso della circolazione e con apposite disposizioni accolse chi voleva trasferirsi a Livorno e a Pisa a prescindere dalla nazionalità e dalla religione.
Fra Ferdinando e Enrico IV nacquero tensioni a causa del timore del granduca di rischiare di trovarsi troppo esposto all'ira di Filippo II per aver sostenuto il sovrano francese che si era dimostrato ingrato ed aveva accumulato enormi debiti nei confronti del granducato. Ferdinando stabilizzò la situazione riuscendo a far includere il granducato di Toscana nel trattato di pace tra Spagna e Francia firmato a Vervins nel 1598. Inoltre il matrimonio di Enrico IV con Maria de'Medici, figlia di Francesco (4 ottobre 1600), assicurò a Ferdinando un'importante alleanza all'interno della corte francese.
Inizialmente molto difficile fu il rapporto di Ferdinando con il nuovo re di Spagna Filippo III salito al trono nel 1598 che negò di riconoscere il dominio dei Medici su Siena e riportò in tribunale le vecchie vertenze ereditarie di Pietro de'Medici. Nel 1604, con la morte di Pietro, la tensione diminuì e nel 1605 Filippo III concesse al granduca l'investitura di Siena mentre nel 1607 Cosimo, figlio primogenito di Ferdinando, sposò Maria Maddalena d'Austria, sorella della regina di Spagna Margherita d'Austria.
Ferdinando de'Medici morì a Firenze il 3 febbraio 1609.