Figlio naturale di Alberto d'Este e Isotta Albaresani, nacque a Ferrara il 9 novembre 1383.
Nel 1393 Alberto V morì e Niccolò III ebbe il titolo di marchese e la signoria sotto la protezione di Venezia con un consiglio di reggenza. Azzo IX d'Este si oppose alla successione e e lotte che seguirono si conclusero con la battaglia di Portomaggiore del 16 aprile 1435 dalla quale Azzo uscì sconfitto.
Nel 1409 Niccolò III fece uccidere Ottobono Terzi impadronendosi di Parma e Reggio Emilia ma nello stesso perioo fu privato di Rovigo dai Veneziani. Si mantenne neutrale riguardo alle lotte tra Venezia e Filippo Maria Visconti ma in seguito ebbe ottimi rapporti con quet'ultimo.
Divenne proverbiale per la sua intensa attività amatoria, tra le sue molte amanti Stella de'Tolomei gli diede tre figli: Ugo, Leonello e Borso.
Niccolò ebbe tre mogli: Gigliola da Carrara dalla quale non ebbe figli; Laura Malatesta detta Parisina dalla quale nacquero Lucia, Ginevra e Alberto Carlo (morto infante), Riccarda di Saluzzo che fu madre di Ercole e Sigismondo.
Niccolò III morì il 26 dicembre 1441, suo successore fu Leonello d'Este, figlio suo e di Stella de'Tolomei.