Figlia di Enrico II di Francia e di Caterina de'Medici, Margherita di Valois nacque il 14 maggio 1553 nel castello di Saint-Germain-en-Laye.
Il 18 agosto 1572 sposò Enrico di Borbone re di Navarra, capo degli ugonotti, matrimonio che nelle intenzioni di Caterina de' Medici doveva rappresentare la pacificazione tra Francesi cattolici e Francesi protestanti, ma sei giorni dopo avvenne la strage di San Bartolomeo, e Enrico fu costretto ad abiurare.
Il rapporto tra Margherita di Valois e il marito Enrico di Navarra fu difficile a causa delle divergenze religiose e delle numerose reciproche infedeltà. Nel 1576 Margherita aiutò il fratello Francesco Ercole duca di Alençon a fuggire dalla prigionia che subiva in quanto capo della fazione antimonarchica dei "Malcontenti" e lo riconciliò con lo zio Enrico III divenuto re di Francia nel 1575. Il progetto di porre Francesco Ercole a capo di un regno autonomo nei Paesi Bassi fallì per la morte di lui avvenuta nel 1584.
Nel 1585 Margherita provocò l'ira del marito aderento alla Santa Lega fondata da Enrico di Guisa e fu rinchiusa nel castello di Usson dove rimase prigioniera per venti anni.
Nel 1589 Enrico III fu assassinato e Enrico di Borbone, suo erede più prossimo in vita, salì al trono di Francia come Enrico IV.
Nel 1600 Enrico IV chiese l'annullamento del matrimonio, Margherita acconsentì ricevendo un lauto compenso e una pensione vitalizia. Enrico sposò Maria de' Medici e ne nacque Luigi XIII al quale Margherita si affezionò al punto di nominarlo suo erede universale.
Margherita fu liberata nel 1605 e, dopo pochi mesi trascorsi a Neuilly-sur-Seine, tornò a vivere a Parigi dove aprì un salotto letterario di grande prestigio e si dedicò a opere di beneficenza.
Enrico IV fu assassinato nel 1610 e la moglie Maria de'Medici assunse la reggenza per il figlio minorenne. Margherita fu in ottimi rapporti con Maria che durante la reggenza le affidò incarichi politici e missioni diplomatiche.
Margherita morì il 27 marzo 1615 a Parigi.
Sulla sua vita, nel 1845, Alexandre Dumas padre scrisse il romanzo La regina Margot descrivendola come un personaggio libertino, esagerando la realtà.