Figlio di Cosimo I e di Eleonora di Toledo, nacque a Firenze il 25 marzo 1541.
Durante l'infanzia fu studente volonteroso e ricettivo ma di carattere malinconico e soggetto a bruschi cambiamenti di umore, caratteristiche che negli anni giovanili lo portarono a perdere la fiducia del padre che lo escluse dagli impegni di governo.
Per allontanarlo dalle cattive compagnie Cosimo mandò Francesco in Spagna richiamandolo nel 1564 per affidargli la reggenza del ducato ma riservandosi il controllo degli affari più importanti.
Poco dopo Francesco iniziò un'appassionata relazione con Bianca Capello suscitando la preoccupazione e l'indignazione di Cosimo che dovette sperare di risolvere il problema con il matrimonio, per altro già programmato, di Francesco con Giovanna d'Asburgo, sorella dell'imperatore Massimiliano II. Il matrimonio fu celebrato con grande pompa a Firenze il 18 dicembre 1565.
Negli anni successivi il perdurare della relazione di Francesco con Bianca Capello provocò diversi scandali ma Cosimo, che dopo la morte della moglie si era lasciato andare a svariate avventure galanti prima di risposarsi con Camilla Martelli, evitò di intervenire ancora nelle faccende private del figlio.
Cosimo morì il 21 aprile 1574 e Francesco rimase unico signore del Granducato ma, privo delle capacità politiche del padre e trovandosi a fronteggiare grandi difficoltà economiche dello stato, lasciò gran parte del potere nelle mani di funzionari e consiglieri e si comportò in genere come un vassallo dell'imperatore.
Dopo la morte della moglie Giovanna, avvenuta nel 1578, Francesco sposò Bianca Capello.
Morì improvvisamente il 19 ottobre 1587 nella sua residenza di Poggio Caiano, il giorno successivo moriva anche la moglie Bianca e si credette che la coppia fosse stata fatta avvelenare dal cardinale Ferdinando de'Medici fratello di Francesco e suo successore, ma esami scientifici eseguiti nel 2009 sui resti delle salme hanno dimostrato che causa della morte fu la malaria.
Da Giovanna d'Asburgo Francesco aveva avuto Eleonora, Anna, Maria e altri quattro figli morti in tenera età.
Da Bianca Capello era nato Antonio ma secondo alcune fonti fu un figlio illegittimo o adottivo.