Figlio di Francesco Maria I della Rovere e di Eleonora Gonzaga, nacque a Urbino il 2 aprile 1514.
Ereditò nel 1538 il titolo di duca di Urbino, aveva già retto il ducato in via provvisoria, nel 1532 durante un'assenza del padre.
Nel 1546 ebbe dalla Repubblica di Venezia la condotta generale delle armi venete.
Nel 1573 represse duramente una rivolta della popolazione nel ducato di Urbino. Sposò nel 1534 Giulia da Varano dalla quale ebbe una figlia di nome Virginia. Rimasto vedovo nel 1547, il 26 gennaio 1568 sposò Vittoria Farnese dalla quale nacquero Maria, Isabella e Lavinia.
Morì di malattia a Pesaro il 28 settembre 1574.