Figlia di Bonifacio marchese di Toscana e di Beatrice di Lotaringia, nacque nel 1046 probabilmente a Mantova.
Il padre apparteneva alla potente famiglia feudataria di Canossa, la madre ad una casata tedesca imparentata con i duchi di Svevia. Cresciuta nella ricca corte feudale dei genitori, Matilde ricevette un'educazione molto superiore a quelle che in genere toccava alle donne della sua epoca.
Nel 1052 il padre Bonifacio rimase vittima dell'attentato di un vassallo e l'anno successivo morirono in circostanze mai chiarite i fratelli Federico e Beatrice.
Nel 1054 Beatrice si risposò con Goffredo il Barbuto duca della Bassa Lotaringia, padre di Goffredo il Gobbo. Questa unione fra due famiglie tanto importanti, avvenuta senza l'autorizzazione imperiale, provocò l'ira dell'imperatore Enrico III che fece arrestare Beatrice e Matilde e le trattenne a lungo in Germania alla sua corte.
Nel 1056 Enrico III morì e Beatrice tornò in Toscana con il marito. Trascorse un decennio sul quale abbiamo scarse notizie, nel 1067 Beatrice e Matilde si trasferirono in Lorena dove Goffredo il Barbuto morì nel 1069 e dove Matilde sposò il fratellastro Goffredo il Gobbo, figlio di prime nozze di Goffredo il Barbuto, dal quale ebbe una bambina che morì quasi subito.
Beatrice tornò in Italia e Matilde la seguì abbandonando il marito nel 1072.
Goffredo cercò più volte la riconciliazione anche con il sostegno del nuovo papa Gregorio VII ma Matilde rifiutò categoricamente di riunirsi al marito.
Gregorio VII chiese ed ottenne il supporto delle due contesse nella lotta per le investiture, intanto si guastavano i rapporti fra il pontefice e Goffredo il Gobbo che nel 1076 a Worms fu fra quanti approvarono la deposizione di Gregorio VII.
Pochi giorni dopo la dieta di Worms, Goffredo venne assassinato ed alcuni sospettarono che Matilde fosse la mandante dell'omicidio.
Gregorio VII reagì alle decisioni di Worms con la scomunica di Enrico IV.
Beatrice morì a Pisa il 18 aprile 1076 e in quel periodo Matilde si trovò impegnata su più fronti: l'ordinario governo dei suoi vasti domini, la difficile situazione politica nello scontro fra Enrico IV, con il quale aveva vincoli di parentela e obblighi di vassallaggio, e Gregorio VII al quale era legata da sincera e profonda amicizia oltre che da sentimenti religiosi. Si occupò inoltre di entrare in possesso dell'eredità del marito, operazione non semplice nella quale fu decisivo il supporto dell'autorità papale di Gregorio VII.
La scomunica aveva fortemente indebolito la posizione di Enrico IV il quale non poteva sottovalutare l'effetto del provvedimento sulla morale religiosa dei suoi sudditi ed il vantaggio che la situazione forniva ai suoi avversari.
Anche Gregorio VII era in difficoltà per vari motivi e Roberto il Guiscardo aveva già conquistato Salerno e si presentava come una seria minaccia per gli equilibri politici del momento. Per questi motivi Gregorio VII decise di incontrare l'imperatore e si mise in viaggio verso la Germania ma a Mantova fu informato che Enrico IV, con analoga decisione, stava scendendo in Italia. Il papa si ritirò quindi nel castello di Canossa mentre Matilde si faceva carico delle trattative insieme ad Ugo di Cluny.
I due mediatori incontrarono l'imperatore il 20 gennaio 1077 nei pressi di Canossa e lo convinsero a chiedere udienza al papa in veste di penitente.
Notoriamente l'incontro fra Gregorio e Enrico fu preceduto da tre giorni di pubblica penitenza dell'imperatore vestito di un saio e scalzo alla porta del castello, un evento epocale ma non decisivo.
Enrico IV ottenne il perdono ma poco dopo organizzò l'arresto del papa e della contessa, questi ne furono informati ed evitarono la cattura fermandosi nei territori di lei per alcuni mesi e recandosi a Roma a settembre.
Intanto in Germania Rodolfo di Svevia veniva incoronato in opposizione ad Enrico IV aprendo una lotta che portà ad una vittori di Enrico nella battaglia di Flacheim del 27 gennaio 1080.
Gregorio, che in un primo momento non aveva riconosciuto Rodolfo, scomunicò di nuovo Enrico IV il 7 marzo 1080 mentre l'imperatore lo dichiarava deposto e il 25 giugno faceva eleggere Wiberto arcivescovo di Roma che prese il nome di Clemente III.
Il 15 ottobre 1080 Rodolfo di Svevia morì per le ferite riportate nella battaglia di Merserburg mentre i vescovi dell'Italia settentrionale contrari a Gregorio VII sconfiggevano l'esercito di Matilde presso Mantova.
Nel 1081 Enrico IV scese in Italia per insediare Clemente III e fu costretto a raggiungere Roma per un percorso più lungo perché Matilde gli negava il transito nelle sue terre.
L'imperatore non riuscì ad entrare in Roma e retrocedette verso nord mentre emanava un decreto per condannare Matilde e privarla dei suoi poteri. Enrico IV invase la Toscana e Matilde fu costretta a ritirarsi nei suoi possedimenti emiliani.
Dopo ripetuti tentativi, Enrico IV occupò Roma ed insediò Clemente III nel 1084 mentre Gregorio VII si rifugiava in Castel Sant'Angelo e Matilde, che aveva già devoluto ingenti fondi in favore del pontefice, non riusciva a fornire ulteriori aiuti.
Il 27 maggio 1084 l'esercito di Roberto il Guiscardo cacciò gli imperiali da Roma ma saccheggiò la città. Roberto il Guiscardo tentò senza successo di conquistare Tivoli, quindi si ritirò e Gregorio VII lo seguì a Salerno dove morì il 25 maggio 1085.
Matilde aveva intanto riorganizzato le sue risorse e riconquistato parte dei domini sottrattile. Prese a dare aiuto e rifugio ai sostenitori di Gregorio VII come Bonizone vescovo di Sutri, Anselmo da Baggio ed Ermanno di Meltz, tutti esuli per volontà dell'imperatore.
La contessa appoggiò l'elezione quale successore di Gregorio VII di Vittore III (Dauferio abate di Montecassino) ma questi era anziano e malato e presto si ritirò a Montecassino lasciando che il rivale Clemente III rientrasse a Roma; Matilde lo riaccompagnò a Roma e lo insediò a San Pietro mentre Clemente III si rifugiava nel Pantheon.
La popolazione era divisa e si verificarono tumulti, Vittore III prevalse ma dovette tornare presto a Montecassino per motivi di salute e vi morì il 16 settembre 1087.
Fu eletto Oddone di Ostia che prese il nome di Urbano II e consigliò a Matilde di sposare Guelfo V di Baviera perché l'aiutasse a fronteggiare Enrico IV del quale era storico avversario.
Enrico IV tornò in Italia e nel 1091 espugnò Mantova proseguendo la guerra contro Matilde durante l'anno successivo.
Nell'autunno le truppe imperiali arrivarono a minacciare direttamente Canossa ma furono duramente sconfitte mentre Milano ed altre città lombarde, ribelli al potere imperiale, si avvicinavano alla contessa. Presso Matilde trovarono asilo anche Corrado e Prassede, rispettivamente primo figlio e seconda moglie di Enrico IV quando gli si ribellarono.
Enrico IV rientrò in Germania nel 1097 e Matilde, ripreso pieno possesso dei suoi domini, tornò alle normali attività di governo ed alla sua politica di sostegno della Chiesa e dei vescovi riformatori.
Enrico IV morì il 7 agosto 1106, deposto ed imprigionato dal figlio Enrico V. Questi scese in Italia nel 1110 per ottenere l'incoronazione dal papa Pasquale II e nel 1111 fu stipulato, forse con la mediazione di inviati di Matilde, l'accordo di Sutri fra il papa e l'imperatore.
Enrico V tuttavia non tenne fede all'accordo e catturò Pasquale II costringendolo a riconoscergli il privilegio delle investiture.
Durante il suo ritorno in Germania, Enrico V revocò le sanzioni stabilite dal padre contro Matilde e la reinsediò ufficialmente al potere; nel 1114 la contessa rientrò in possesso di Mantova.
Matilde morì a Bondeno di Roncore il 24 luglio 1115 e fu sepolta nell'Abbazia di San Benedetto Polirone da dove il suo corpo fu traslato in San Pietro nel 1632 per volontà di Urbano VIII.